Menu

Időtartam: 2017.12.01 - 2019.12.01

szivprogram  szechenyi2020 logo

A kutatócsoportról


Kutatási terület:

Extracelluláris vezikulák szerepe a kardiovaszkuláris megbetegedésekben


A Nemzeti Szívprogram keretén belül kitűzött kutatásfejlesztési célok:

  • A humán pericardiális folyadék sejtes összetételének, extracellulárisvezikuláinak és sejtek közötti kommunikációjának vizsgálata szívátültetés során eltávolított donor és recipiens, valamint coronaria bypass műtéten átesett betegek esetében multiomikai megközelítéssel.
  • A lipoproteineknekextracellulárisvezikulákkal történő, elsőként kutatócsoportunk által leírt asszociációjának a vizsgálata. A lipoprotein-extracellulárisvezikula komplexek hatásának vizsgálata a sejtek általi felvételre, a „habos sejt” átalakulásra és a máj általi eliminációra in vitro és egérmodellekben.
  • Humán és egér szívizomsejt eredetű extracellulárisvezikulák vizsgálata multiomikai módszerekkel, szívizomsejt eredetű extracellulárisvezikula markerek azonosítása és validálásaischemiás szívbetegségben szenvedő betegek vérplazmájának áramlási citometriás elemzésével. Extracellulárisvezikula alapú diagnosztikus panel létrehozása.

 

A Nemzeti Szívprogram pályázati keretéből beszerzett infrastruktúra:

Intézetünkben 2018. június óta üzemel a Sony LE-SH800SFP kollineáris áramlási citométer és szorter. A készülék kompakt méretű (55 cm x 55 cm x 72 cm), műszeregysége elfér egy laboratóriumi asztalon, fluidikai egységei pedig az asztal alatt. 7. emeleti 708. „Nagy” laboratóriumunkban helyeztük el egy rezgésmentes asztalon. A készülék bekapcsolása, az áramlási és az optikai rendszerek optimalizálása teljesen automatikusan, beavatkozás-mentesen történik. A készülék ehhez szintetikus gyári beadeket használ. A beállítás más, hasonló teljesítményű sejtszorter készülékek esetében többnyire manuálisan történik és időigényes folyamat. Ezért ez a berendezés nagyon felhasználóbarát.

A Sony LE-SH800SFP szorter architektúrája két szempontból különleges:

1. Az áramlási kamra (Flow Cell) az áramlási citométerek legfontosabb és legprecízebb alkatrésze. Ebben jön létre a minta hidrodinamikus fókuszálása révén a mintaáram (stream), melyben a sejtek egymás után, egyesével haladnak a burkolófolyadék közepén egy szűk folyadékáramban; továbbá itt történik a sejtek megvilágítása a gerjesztő lézerekkel, és a fluoreszcens emisszió leolvasása is.  Ezen kívül a folyadékcsepp-szorterekben az áramlási kamra kimeneti apertúráján keletkezik a lineáris aeroszol, melyben az egymás után repülő folyadékcseppek tartalmazzák a sejteket. Az LE-SH800SFP készülékben az áramlási kamra egy eldobható műanyag alkatrészben található, melyet Microfluidic Sorting Chipnek (röviden Chipnek) neveznek. A készülék ily módon biztosítja, hogy a folyadékáram és az aerosol minden bekapcsolás alkalmával ugyan olyan legyen, megkönnyítve ezzel a rendszer optimalizálását és megnövelve stabilitását. Természetesen ez kissé megnöveli a mérésenkénti fajlagos költségeket (1 chip ára kb. 10 000Ft). A köpenyfolyadék és a minta injekciója a hagyományos, nyomásvezérelt módon történik. A Chipek 3 féle pórusméretben vásárolhatók (70µm, 100µm és 130µm) különböző méretű sejtek méréséhez és szortolásához. Eddigi tapasztalataink szerint az immunológiai kutatások során vizsgált primer sejtek (limfociták, monociták), valamint a kisebb méretű daganatsejt-vonalak szortolása többnyire a 100µm-es Chipekkel végezhető eredményesen (a gyártó ajánlásainak megfelelően). A 70µm-e apertúrával még nem szereztünk tapasztalatot. Néhány kísérletben, ahol kifejezetten nagyméretű (melanoma malignum) sejtek szétválogatását kellett elvégezni, a 130µm Chippel végeztük a szortolást. Egy Chip kb. 24 óra folyamatos szortolásra használható amennyiben a készülék 405nm-es lézerét is használjuk a mérés során (mivel a távoli ibolyaszínű fény hátrányosan befolyásolja a műanyag stabilitását). Amennyiben csak a többi lézert használjuk, a chip hosszabb ideig is használható.

2. Az LE-SH800SFP szorter másik különleges jellegzetessége a 4 lézer (kék: 488nm, sárga-zöld: 561nm, vörös: 638nm és ibolya 405nm) kollineáris elhelyezkedése. Ez azt jelenti, hogy a lézerek fénye együtt, egy nyalábban éri el a folyadékáramban haladó sejteket. Ennek következtében a készülék nem tud különbséget tenni a különböző hullámhosszúságú fénnyel gerjesztett, viszont hasonló tartományban emittáló fluoreszcens festékek szignáljai között. A különleges optikai felépítés előnye, hogy nagy sebességgel is pontosan lehet vele mérni. Saját tapasztalatain szerint problémamentesen lehet 10 000-11 000 sejt / másodperc sebességgel mérni és szortolni. A kollineáris felépítés hátránya, hogy feltétlenül szükséges a készülék sajátosságainak figyelembe vétele a fluoreszcens festék-panelek tervezésekor. Alapvetően kétféle üzemmódban lehet a bekapcsolni a készüléket, attól függően, hogy használjuk-e a 405 nm-es lézert, vagy nem. Mindkét esetben 6 fluoreszcens csatorna áll rendelkezésre, de ezek kiosztása különböző. 405nm-es lézer nélkül (a jellegzetes festékek rövidítésével) FITC, PE, PE-Texas Red, APC, Alexa Fluor 700 és PE-Cy7 festékek emissziójának megfelelő csatornák, míg 405nm-es lézer használatával Pacific Blue, FITC, PE, APC, Alexa Fluor 700 és PE-Cy7 festékek emissziójának megfelelő csatornák állnak rendelkezésre. Fontos megjegyezni azonban, hogy a kollineáris felépítés miatt a különböző lézerek által gerjesztett, de azonos tartományban emittáló festékek nem használhatók együtt, mert a szignáljukat nem képes elkülöníteni a gép (szemben más, hagyományos felépítésű készülékekkel, ahol ezeket a festékeket különböző csatornákon detektálhatjuk). Így például mindkét üzemmódban kerülendő a PerCP-Cy5.5 használata, mivel mind az APC, mind az Alexa Fluor 700 szignáljával átfed, illetve a PE-Cy7 és az APC-Cy7 sem használható együtt. Hasonló módon a 405nm-es lézer használata esetén a PE és a Brilliant Violet 605, valamint az Alexa Fluor 700 és a Brilliant Violet 711 emissziója ütközik.

A készülék rendelkezik fluoreszcens proteinek mérésére alkalmas külön szűrőkészlettel is. A szortolás 2 csőbe vagy 6-96 lyukú mikrotiter lemezek welljeibe lehetséges. Ez utóbbi esetben lehetőség van akár wellenként 1-1 sejt szortolására is; továbbá a készülék képes úgynevezett indexált szortolás végzésére, azaz rögzíteni tudja minden egyes kiszortolt sejt koordinátáit (fluoreszcens intenzitás értékeit) az összes vizsgált csatornában és a forward-, valamit backscatter (sidescatter) detektorokon. Így az egyes sejtek klónozása során visszakövethető a kiindulási sejt pontos, a szortoláskor mért immunfenotípusa.

A szorter szoftvere intuitív, könnyen megbirkózik akár 10-20 millió lemért sejt elemzésével is. Az elektronikus abortációs ráta még nagy sebességű szortolás esetén sem magas. A készülék évente egyszer igényel a forgalmazó által végzett nagy karbantartást. Ezen kívül havonta egyszer szükséges a belső, és használattól függően 3-6 havonta az összes folyadékvezeték átmosása etanollal. Ilyenkor a mintafelszívó csövet is célszerű cserélni.

A beszerzés óta eltelt 31 hónapban a készülékkel számos különböző alkalmazás futtatása révén szereztünk tapasztalatot. Általánosságban elmondható, hogy jó életképességű kiindulási sejtek esetén a kiszortolt sejtek tovább élnek, sejtkultúrában szaporíthatók. A szortolás a nagy expressziós különbséget mutató sejtek szétválogatása során nagy tisztaságú populációkat eredményez, ami a kiszortol sejtek visszamérésével ellenőrizhető. Az alábbiakban felsorolunk néhányat az eddig elvégzett kísérletek közül:

1. Nagy mennyiségű, transzfektált, fluoreszcens proteineket expresszáló és nem expresszáló sejt szétválogatása (pl.: GFP HEK sejtek).

2. Kis expressziós különbséget mutató tumorsejtek szétválasztása. A kísérlet során vastagbélrák sejtpopulációkat választottuk szét egy, a tumornövekedést elősegítő kandidáns sejtfelszíni marker expressziója alapján. A cél a lehetséges tumorőssejtek izolálása volt.

3. Humán és egér regulációs T (Treg) sejt alcsoportok szortolása vérből és szövetekből.

4. Humán innate lymphoid sejtek (ILC-k) szortolása vérből. Az ILC-k nagyon ritka sejtek, egészséges  donorokperifériás vérében megközelítőleg a limfociták 0,19‰-e ILC1, 0,16‰-e ILC2 és 0,29‰-e ILC3.

5. Egysejt szortolás 96 welles lemezre, CRISPR/Cas9 rendszerben módosított human choriocarcinoma (BeWo) sejtek klónozása céljából.

A Sony LE-SH800SFP sejtszorter eddig a várakozásainknak megfelelően működött. Reméljük hogy hosszú távon is megbízható marad a készülék.


Honlap: 

http://semmelweis.hu/tcs/kutatocsoportok/nvkp-kutatocsoportok/ 

 

Tagok

Vezető:


  BuzasE

Dr. Buzás Edit, egyetemi tanár, az MTA doktora

 

 Tagok:


  BariczaE

Joóné Baricza Eszter, tudományos segédmunkatárs

  Hegyesi Hargita

Dr. Hegyesi Hargita, egyetemi docens

 

  PallingerE

Dr. Pállinger Éva, egyetemi docens

  PalocziK

Pálóczi Krisztina, intézeti mérnök

 

  Tamasi Viola

Dr. Tamási Viola, egyetemi docens

 

  Visnovitz Tamas

Dr. Visnovitz Tamás, tudományos munkatárs

 

 

 

Go to top