1. Beckman Coulter álló ultracentrifuga

Genetikai, sejt és Immunbiológiai Intézet NET VI. emelet 603. laboratórium

Az ultracentrifugák használata elengedhetetlen az extracelluláris vezikulák (EV-k) izolálásához, hiszen

• Az EV-k nagyon apró részecskék, amelyeknek a hatékony izolálásához rendkívül magas fordulatszám és g-erő szükséges. Ezt a centrifugálási erőt hagyományos centrifugákkal lehetetlen elérni.
• Az ultracentrifugálák ugyanakkor minimalizálja a mechanikai stresszt, amely károsíthatná az EV-ket. Ez különösen fontos, mivel az EV-k különösen egyébként is alacsony koncentrációjú, érzékeny lipid-fehérje struktúrák, amelyek könnyen sérülhetnek.
• Az általában relatív alacsony koncentrációk mellett, az ultracentrifugák nagy kapacitású rotorjai mégis lehetővé teszik nagy mennyiségű minta egyidejű feldolgozását, ami hatékonyabbá teszi az EV-k izolálását.
• Az ultracentrifugák precíz mennyiségekkel, nagy erőkkel és szigorú vezérléssel dolgoznak, ami biztosítja az izolálási folyamatok reprodukálhatóságát, ami kritikus a kutatási és diagnosztikai alkalmazásokban.

Az EV izolálás alapja egy megbízható ultracentrifuga, ami biztosítja vizsgált az extracelluláris vezikulák magas tisztaságát és integritását a kutatási és klinikai alkalmazásokhoz.

Az intézet, a VEKOP-2.3.3-15-2016-00016 pályázat segítségével, egy Beckman Coulter Optima XPN ultracentrifugát vásárolt:

• Ez egy csúcstechnológiás készülék, amelyet különféle laboratóriumi alkalmazásokhoz terveztek
• Maximális sebessége 100 000 RPM
• A hozzá tartozó 100, Type 100 TI, TY-25 and SW-32T rotorok különböző léptékű izolálásokat tesznek lehetővé.

Mivel az tiszta, megbízható izolálás az EV vizsgálatok első, megkerülhetetlen lépése, az ultracentrifuga lényegében teljes kihasználtságon folyamatosan működik, és a legtöbb kutatás alappillére, ha az izolálási lépés maga kevésbé is látványos.

Publikációs lista az ultracentrifuga felhasználásával (bővülő lista):

1. Mladenović D, Khamari D, Kittel Á, Koort K, Buzás EI, Zarovni N. Acidification of blood plasma facilitates the separation and analysis of extracellular vesicles. J Thromb Haemost. 2023 Apr;21(4):1032–42.
2. Németh K, Kazsoki A, Visnovitz T, Pinke B, Mészáros L, Buzás EI, et al. Nanofiber formation as a promising technology for preservation and easy storage of extracellular vesicles. Sci Rep. 2022 Dec 20;12(1):22012.
3. Hegyesi H, Pallinger É, Mecsei S, Hornyák B, Kovácsházi C, Brenner GB, et al. Circulating cardiomyocyte-derived extracellular vesicles reflect cardiac injury during systemic inflammatory response syndrome in mice. Cell Mol Life Sci. 2022 Jan 20;79(2):84.
4. Kelemen A, Carmi I, Oszvald Á, Lőrincz P, Petővári G, Tölgyes T, et al. IFITM1 expression determines extracellular vesicle uptake in colorectal cancer. Cell Mol Life Sci. 2021 Nov;78(21–22):7009–24.
5. Rzepiel A, Horváth A, Kutszegi N, Gézsi A, Sági JC, Almási L, et al. MiR-128-3p as blood based liquid biopsy biomarker in childhood acute lymphoblastic leukemia. Mol Cell Probes. 2023 Feb;67:101893.
6. Koncz A, Turiák L, Németh K, Lenzinger D, Bárkai T, Lőrincz P, et al. Endoplasmin Is a Hypoxia-Inducible Endoplasmic Reticulum-Derived Cargo of Extracellular Vesicles Released by Cardiac Cell Lines. Membranes (Basel). 2023 Apr 13;13(4). 

2. Nanorészecske számláló (ZetaView, ParticleMetrix)

Genetikai, Sejt és Immunbiológiai Intézet NET VI. emel et 609. laboratórium

A vezikulakutatás a kihívása a apró méretű vezikulák izolálása mellett ezeknek a kis sejtalkotóknak az azonosítása. A méretük miatt a pontos azonosításuk is kihívásokkal teli feladat, ami megbízhatóan csak különböző egymásra épülő és egymást kiegészítő technikákkal lehetséges. Ezekkel a technikákkal vizsgáljuk többek között

• a részecskék számát és méreteloszlását
• felszíni markereit

mikroszkópos képét.

Ezek közül a részecskék számának és méreteloszlásának vizsgálatához az intézet a VEKOP-2.3.3-15-2016-00016 pályázat segítségével, ZetaView készüléket vásárolt.

A ZetaView egy fejlett Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) eszköz, amelyet a részecskék hidrodinamikai méretének, zéta potenciáljának és koncentrációjának mérésére terveztek. Képes többek között

• A Részecskék egyedi követésére klasszikus mikro-elektroforézis és Brown-mozgás alkalmazásával.
• Az EV-k méretét és koncentrációját pontos meghatározására, ami alapvető fontosságú a kvantitatív elemzésekhez.
• Zéta potenciál mérésére. A zéta potenciál a részecskék felületi töltéséről és stabilitásáról ad információt. Ez különösen fontos a vezikulák biológiai funkcióinak és interakcióinak megértéséhez.
• Fluoreszcens részecskék követésére és elemzésére különböző hullámhosszokon.
• Automatikus igazításra és fókuszálásra, ami biztosítja a könnyű kezelhetőséget és a megbízható eredményeket.

A készülék képes zéta potenciál mérésére és az alábbi lézert tartalmazza: 520 nm 35mW

Publikációs lista a Zetaview felhasználásával (bővülő lista):

1. Kelemen A, Carmi I, Oszvald Á, Lőrincz P, Petővári G, Tölgyes T, et al. IFITM1 expression determines extracellular vesicle uptake in colorectal cancer. Cell Mol Life Sci. 2021 Nov;78(21–22):7009–24.
2. Németh K, Varga Z, Lenzinger D, Visnovitz T, Koncz A, Hegedűs N, et al. Extracellular vesicle release and uptake by the liver under normo- and hyperlipidemia. Cell Mol Life Sci. 2021 Dec;78(23):7589–604.
3. Hegyesi H, Pallinger É, Mecsei S, Hornyák B, Kovácsházi C, Brenner GB, et al. Circulating cardiomyocyte-derived extracellular vesicles reflect cardiac injury during systemic inflammatory response syndrome in mice. Cell Mol Life Sci. 2022 Jan 20;79(2):84.
4. Németh K, Kazsoki A, Visnovitz T, Pinke B, Mészáros L, Buzás EI, et al. Nanofiber formation as a promising technology for preservation and easy storage of extracellular vesicles. Sci Rep. 2022 Dec 20;12(1):22012.
5. Mladenović D, Khamari D, Kittel Á, Koort K, Buzás EI, Zarovni N. Acidification of blood plasma facilitates the separation and analysis of extracellular vesicles. J Thromb Haemost. 2023 Apr;21(4):1032–42.
6. Koncz A, Turiák L, Németh K, Lenzinger D, Bárkai T, Lőrincz P, et al. Endoplasmin Is a Hypoxia-Inducible Endoplasmic Reticulum-Derived Cargo of Extracellular Vesicles Released by Cardiac Cell Lines. Membranes (Basel). 2023 Apr 13;13(4). 

3. Nagy érzékenységű áramlási citométer (ApogeeA60 MicroPlus)

Genetikai, Sejt és Immunbiológiai Intézet NET VI. emel et 609. laboratórium

A vezikulák apró méretükből adódóan, hagyományos módszerekkel sokszor nehezen elemezhetőek, ezért az igazán hatékony, meggyőző vizsgálatuk különböző áramlási citométerekkel történik. Az EV-k vizsgálatára használható citométernek képesnek kell lennie

• Kivételes érzékenységre: az EV-ka aprók, kevés fényt szórnak, a sejttörmeléktől és fehérje aggregátumoktól sokszor nehezen elkülöníthetők
• nagy sebességrű eseményrögzítésre: másodpercenként több tíz, vagy akár százezer részecske is elhaladhat az érzékelők előtt, ezeket nagy számban képesnek kell lennie az eszköznek detektálni
• automatizálhatóság: mind a mérési, mind a tisztítási lépésekben, ami csökkenti az emberi beavatkozás mértékét, és növeli a mérések reprodukálhatóságát.

Az intézet EV-k ilyenforma vizsgálatára, a VEKOP-2.3.3-15-2016-00016 pályázat segítségével, Apogee A60-Micro-PLUS csúcstechnológiás áramlási citométer vásárolt, amelyet kifejezetten kis részecskék, többek között extracelluláris vezikulák mérésére fejlesztettek.

Az eszköz:

• Kivételes érzékenységgel rendelkezik: akár 110 nm átmérőjű részecskék mérésére is alkalmas, ami különösen kiemeli a hasonló műszerek közül, és a legkritikusabb tartományban pontosabb méréseket tesz lehetővé.
• Nagy sebesség: Akár 100 000 eseményt is képes rögzíteni másodpercenként
• Automatizálható a mérés és a tisztítás
• Magas áteresztőképességű és reprodukálható méréseket tesz lehetővé
• Felhasználóbarát szoftverrel érkezik, ami megkönnyíti a eredmények értelmezését és kiértékelését.

A készülék jelenleg az alábbi lézereket tartalmazza: 405 nm, 488 nm és 638 nm

Publikációs lista az Apogee felhasználásával (bővülő lista):

Koncz A, Turiák L, Németh K, Lenzinger D, Bárkai T, Lőrincz P, et al. Endoplasmin Is a Hypoxia-Inducible Endoplasmic Reticulum-Derived Cargo of Extracellular Vesicles Released by Cardiac Cell Lines. Membranes (Basel). 2023 Apr 13;13(4).

Bognar Z, Csabai TJ, Pallinger E, Balassa T, Farkas N, Schmidt J, et al. The effect of light exposure on the cleavage rate and implantation capacity of preimplantation murine embryos. J Reprod Immunol. 2019 Apr;132:21–8.

Kovács ÁF, Láng O, Turiák L, Ács A, Kőhidai L, Fekete N, et al. The impact of circulating preeclampsia-associated extracellular vesicles on the migratory activity and phenotype of THP-1 monocytic cells. Sci Rep. 2018 Apr 3;8(1):5426.

Pallinger E, Bognar Z, Bogdan A, Csabai T, Abraham H, Szekeres-Bartho J. PIBF+ extracellular vesicles from mouse embryos affect IL-10 production by CD8+ cells. Sci Rep. 2018 Mar 16;8(1):4662. 

4. Lézer konfokális mikroszkóp (Leica)

Farmakológiai és Farmakoterápiás Intézet IV. emelet 403. laboratórium

A vezikula kutatásban a részecskék vizualizációja a validáció egyik módja, de magából a vizualizációból, lokalizációból, fluoreszcens jelölésből olyan biológiai információk is nyerhetők, amik az izolált vezikulák vizsgálatával nem megszerezhetők.

A konfokális mikroszkópok lézerfény segítségével pontról pontra pásztázzák a mintát, így nagy felbontású (akár 0,1 mikrométeres), háromdimenziós képeket készít relatív alacsony háttérzajjal és magas kontraszttal. Fluoreszcencia alapú képalkotással kiegészítve pedig lehetőség nyílik specifikus molekulák és struktúrák megjelölését és vizsgálatát a mintában.

EV-k vizualizációjához az intézet a VEKOP-2.3.3-15-2016-00016 pályázat segítségével, Leica lézer konfokális mikroszkópot vásárolt. A mikroszkóp képes

• Nagy felbontású képalkotásra, ami lehetővé teszi a vezikulák morfológiájának és méretének pontos meghatározásához.
• Fluoreszcencia képalkotásra, ami lehetővé teszi az EV-k specifikus jelölését és vizsgálatát, ezzel pedig az EV-k különböző populációinak azonosítását és jellemzését.
• Háromdimenziós rekonstrukcióra, ahol a mikroszkóp háromdimenziós képeket készít, az EV-k térbeli eloszlásának és interakcióinak vizsgálatához.
• Automatizációra, ahol a pásztázási és fókuszálási funkciók növelik a mérési pontosságot és csökkentik a felhasználói hibákat.

A készülék képes zéta potenciál mérésére és az alábbi lézereket tartalmazza: Laser 405 nm, Laser Blue 488 nm, Laser Green 552 nm, Laser Red 638 nm

Publikációs lista a konfokális mikroszkóp felhasználásával (bővülő lista):

1. Németh K, Varga Z, Lenzinger D, Visnovitz T, Koncz A, Hegedűs N, et al. Extracellular vesicle release and uptake by the liver under normo- and hyperlipidemia. Cell Mol Life Sci. 2021 Dec;78(23):7589–604.
2. Kelemen A, Carmi I, Oszvald Á, Lőrincz P, Petővári G, Tölgyes T, et al. IFITM1 expression determines extracellular vesicle uptake in colorectal cancer. Cell Mol Life Sci. 2021 Nov;78(21–22):7009–24.
3. Gál Z, Gézsi A, Pállinger É, Visnovitz T, Nagy A, Kiss A, et al. Plasma neutrophil extracellular trap level is modified by disease severity and inhaled corticosteroids in chronic inflammatory lung diseases. Sci Rep. 2020 Mar 9;10(1):4320.
4. Onódi Z, Visnovitz T, Kiss B, Hambalkó S, Koncz A, Ágg B, et al. Systematic transcriptomic and phenotypic characterization of human and murine cardiac myocyte cell lines and primary cardiomyocytes reveals serious limitations and low resemblances to adult cardiac phenotype. J Mol Cell Cardiol. 2022 Apr;165:19–30.