Intézetünkben 2018. június óta üzemel a Sony LE-SH800SFP kollineáris áramlási citométer és szorter. A készülék kompakt méretű (55 cm x 55 cm x 72 cm), műszeregysége elfér egy laboratóriumi asztalon, fluidikai egységei pedig az asztal alatt. 7. emeleti 708. „Nagy” laboratóriumunkban helyeztük el egy rezgésmentes asztalon. A készülék bekapcsolása, az áramlási és az optikai rendszerek optimalizálása teljesen automatikusan, beavatkozás-mentesen történik. A készülék ehhez szintetikus gyári beadeket használ. A beállítás más, hasonló teljesítményű sejtszorter készülékek esetében többnyire manuálisan történik és időigényes folyamat. Ezért ez a berendezés nagyon felhasználóbarát.

A Sony LE-SH800SFP szorter architektúrája két szempontból különleges:

1. Az áramlási kamra (Flow Cell) az áramlási citométerek legfontosabb és legprecízebb alkatrésze. Ebben jön létre a minta hidrodinamikus fókuszálása révén a mintaáram (stream), melyben a sejtek egymás után, egyesével haladnak a burkolófolyadék közepén egy szűk folyadékáramban; továbbá itt történik a sejtek megvilágítása a gerjesztő lézerekkel, és a fluoreszcens emisszió leolvasása is.  Ezen kívül a folyadékcsepp-szorterekben az áramlási kamra kimeneti apertúráján keletkezik a lineáris aeroszol, melyben az egymás után repülő folyadékcseppek tartalmazzák a sejteket. Az LE-SH800SFP készülékben az áramlási kamra egy eldobható műanyag alkatrészben található, melyet Microfluidic Sorting Chipnek (röviden Chipnek) neveznek. A készülék ily módon biztosítja, hogy a folyadékáram és az aerosol minden bekapcsolás alkalmával ugyan olyan legyen, megkönnyítve ezzel a rendszer optimalizálását és megnövelve stabilitását. Természetesen ez kissé megnöveli a mérésenkénti fajlagos költségeket (1 chip ára kb. 10 000Ft). A köpenyfolyadék és a minta injekciója a hagyományos, nyomásvezérelt módon történik. A Chipek 3 féle pórusméretben vásárolhatók (70µm, 100µm és 130µm) különböző méretű sejtek méréséhez és szortolásához. Eddigi tapasztalataink szerint az immunológiai kutatások során vizsgált primer sejtek (limfociták, monociták), valamint a kisebb méretű daganatsejt-vonalak szortolása többnyire a 100µm-es Chipekkel végezhető eredményesen (a gyártó ajánlásainak megfelelően). A 70µm-e apertúrával még nem szereztünk tapasztalatot. Néhány kísérletben, ahol kifejezetten nagyméretű (melanoma malignum) sejtek szétválogatását kellett elvégezni, a 130µm Chippel végeztük a szortolást. Egy Chip kb. 24 óra folyamatos szortolásra használható amennyiben a készülék 405nm-es lézerét is használjuk a mérés során (mivel a távoli ibolyaszínű fény hátrányosan befolyásolja a műanyag stabilitását). Amennyiben csak a többi lézert használjuk, a chip hosszabb ideig is használható.

2. Az LE-SH800SFP szorter másik különleges jellegzetessége a 4 lézer (kék: 488nm, sárga-zöld: 561nm, vörös: 638nm és ibolya 405nm) kollineáris elhelyezkedése. Ez azt jelenti, hogy a lézerek fénye együtt, egy nyalábban éri el a folyadékáramban haladó sejteket. Ennek következtében a készülék nem tud különbséget tenni a különböző hullámhosszúságú fénnyel gerjesztett, viszont hasonló tartományban emittáló fluoreszcens festékek szignáljai között. A különleges optikai felépítés előnye, hogy nagy sebességgel is pontosan lehet vele mérni. Saját tapasztalatain szerint problémamentesen lehet 10 000-11 000 sejt / másodperc sebességgel mérni és szortolni. A kollineáris felépítés hátránya, hogy feltétlenül szükséges a készülék sajátosságainak figyelembe vétele a fluoreszcens festék-panelek tervezésekor. Alapvetően kétféle üzemmódban lehet a bekapcsolni a készüléket, attól függően, hogy használjuk-e a 405 nm-es lézert, vagy nem. Mindkét esetben 6 fluoreszcens csatorna áll rendelkezésre, de ezek kiosztása különböző. 405nm-es lézer nélkül (a jellegzetes festékek rövidítésével) FITC, PE, PE-Texas Red, APC, Alexa Fluor 700 és PE-Cy7 festékek emissziójának megfelelő csatornák, míg 405nm-es lézer használatával Pacific Blue, FITC, PE, APC, Alexa Fluor 700 és PE-Cy7 festékek emissziójának megfelelő csatornák állnak rendelkezésre. Fontos megjegyezni azonban, hogy a kollineáris felépítés miatt a különböző lézerek által gerjesztett, de azonos tartományban emittáló festékek nem használhatók együtt, mert a szignáljukat nem képes elkülöníteni a gép (szemben más, hagyományos felépítésű készülékekkel, ahol ezeket a festékeket különböző csatornákon detektálhatjuk). Így például mindkét üzemmódban kerülendő a PerCP-Cy5.5 használata, mivel mind az APC, mind az Alexa Fluor 700 szignáljával átfed, illetve a PE-Cy7 és az APC-Cy7 sem használható együtt. Hasonló módon a 405nm-es lézer használata esetén a PE és a Brilliant Violet 605, valamint az Alexa Fluor 700 és a Brilliant Violet 711 emissziója ütközik.

A készülék rendelkezik fluoreszcens proteinek mérésére alkalmas külön szűrőkészlettel is. A szortolás 2 csőbe vagy 6-96 lyukú mikrotiter lemezek welljeibe lehetséges. Ez utóbbi esetben lehetőség van akár wellenként 1-1 sejt szortolására is; továbbá a készülék képes úgynevezett indexált szortolás végzésére, azaz rögzíteni tudja minden egyes kiszortolt sejt koordinátáit (fluoreszcens intenzitás értékeit) az összes vizsgált csatornában és a forward-, valamit backscatter (sidescatter) detektorokon. Így az egyes sejtek klónozása során visszakövethető a kiindulási sejt pontos, a szortoláskor mért immunfenotípusa.

A szorter szoftvere intuitív, könnyen megbirkózik akár 10-20 millió lemért sejt elemzésével is. Az elektronikus abortációs ráta még nagy sebességű szortolás esetén sem magas. A készülék évente egyszer igényel a forgalmazó által végzett nagy karbantartást. Ezen kívül havonta egyszer szükséges a belső, és használattól függően 3-6 havonta az összes folyadékvezeték átmosása etanollal. Ilyenkor a mintafelszívó csövet is célszerű cserélni.

A beszerzés óta eltelt 31 hónapban a készülékkel számos különböző alkalmazás futtatása révén szereztünk tapasztalatot. Általánosságban elmondható, hogy jó életképességű kiindulási sejtek esetén a kiszortolt sejtek tovább élnek, sejtkultúrában szaporíthatók. A szortolás a nagy expressziós különbséget mutató sejtek szétválogatása során nagy tisztaságú populációkat eredményez, ami a kiszortol sejtek visszamérésével ellenőrizhető. Az alábbiakban felsorolunk néhányat az eddig elvégzett kísérletek közül:

1. Nagy mennyiségű, transzfektált, fluoreszcens proteineket expresszáló és nem expresszáló sejt szétválogatása (pl.: GFP HEK sejtek).

2. Kis expressziós különbséget mutató tumorsejtek szétválasztása. A kísérlet során vastagbélrák sejtpopulációkat választottuk szét egy, a tumornövekedést elősegítő kandidáns sejtfelszíni marker expressziója alapján. A cél a lehetséges tumorőssejtek izolálása volt.

3. Humán és egér regulációs T (T_reg) sejt alcsoportok szortolása vérből és szövetekből.

4. Humán innate lymphoid sejtek (ILC-k) szortolása vérből. Az ILC-k nagyon ritka sejtek, egészséges  donorokperifériás vérében megközelítőleg a limfociták 0,19‰-e ILC1, 0,16‰-e ILC2 és 0,29‰-e ILC3.

5. Egysejt szortolás 96 welles lemezre, CRISPR/Cas9 rendszerben módosított human choriocarcinoma (BeWo) sejtek klónozása céljából.

A Sony LE-SH800SFP sejtszorter eddig a várakozásainknak megfelelően működött. Reméljük hogy hosszú távon is megbízható marad a készülék.